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    解決方案 | 293T細胞培養攻略
    
        
    
            
        
    
    
    

    

    
    
    
        
    
            
    
                    
    細胞攻略
    293T細胞培養
    細胞特點(diǎn)

    01.細胞貼壁能力比較弱
    293T細胞是貼壁細胞，但其貼壁能力比較弱，容易出現明顯的成片脫落現象。比如：運輸低溫及震蕩、在室溫條件下靜置時(shí)間過(guò)長(cháng)、添加的培養基或其他試劑溫度過(guò)低、培養時(shí)細胞密度過(guò)高、細胞聚集時(shí)未吹散、加液吹打時(shí)觸碰了細胞表面等。
    若脫落現象不嚴重應將細胞盡快放回培養基繼續培養，若出現大片脫落的現象需要收集細胞重新消化吹散再接種。
    建議使用經(jīng)TC處理后的培養器皿培養細胞，如NEST細胞培養瓶、NEST細胞工廠(chǎng)等。



    02.細胞本身偏嗜酸性，培養基消耗較快
    293T細胞在略偏酸性的環(huán)境下生長(cháng)狀態(tài)更好，在培養過(guò)程中需要時(shí)刻注意培養基的pH值。
    在細胞密度達到70%以上時(shí)，細胞培養基的消耗速度較快，需要時(shí)刻觀(guān)察并及時(shí)換液。

    03.細胞生長(cháng)時(shí)聚集成島
    293T細胞生長(cháng)時(shí)呈島狀聚集生長(cháng)，會(huì )逐步向外擴散直到完全融合。

    04.細胞聚集成團之后很難再吹散
    293T細胞傳代過(guò)程中一定要注意吹散細胞，同時(shí)接種的密度不可過(guò)高。密度過(guò)高容易使細胞抱團，導致難以再次吹散，會(huì )在培養器皿中形成類(lèi)似于球狀的聚集體貼壁生長(cháng)。導致即使培養條件合適細胞也難以生長(cháng)。



    細胞培養

    01.細胞凍存
    1. 隨著(zhù)傳代的次數增加，293T細胞會(huì )出現生長(cháng)狀態(tài)下降，出現突變等現象。所以我們需要在細胞購進(jìn)時(shí)就進(jìn)行大量?jì)龃?，以保證實(shí)驗的穩定性和持續性。
    2. 在細胞對數生長(cháng)期進(jìn)行凍存，從而增加細胞復蘇成活率。
    3. 倒去細胞上清液并洗去殘留的培養基。
    4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后移除。
    5. 鏡下觀(guān)察，當293T細胞變圓且細胞間間隙加大時(shí)，加入新鮮培養基吹打混勻。
    6. 細胞計數。
    7. 將細胞離心，1000rpm，2min。
    8.根據計數結果加入細胞凍存液重懸細胞，密度為3×10^6個(gè)/mL。
    9. 將細胞重懸液分裝進(jìn)細胞凍存管，進(jìn)行凍存。
    10. 液氮氣象保存24小時(shí)后建議復蘇一管檢測細胞存活率，細胞狀態(tài)等，若細胞活性合格可長(cháng)期保存，若細胞活性合格率低于80%建議重新凍存。
    注：NEST生物樣本庫解決方案提供細胞凍存全流程產(chǎn)品，如NEST凍存管、NEST凍存液、NEST樣本管理系統、NEST凍存架等。



    02.細胞傳代
    1. 當細胞生長(cháng)至匯合率達到80~90%需要對細胞進(jìn)行傳代操作，以擴大細胞數量，維持細胞良好的生長(cháng)狀態(tài)。
    2. 吸取干凈原有培養基，加入3-4mL常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20秒后舍棄PBS。
    3. 加入適量胰酶，輕輕晃動(dòng)細胞培養瓶使胰酶與細胞充分混勻，徹底消化細胞。
    4. 當細胞間隙變大，但并未完全脫落時(shí)在細胞培養瓶中加入培養基，終止消化?；靹蚣毎?，900rpm離心3-5分鐘后舍棄上清液。
    5. 加入新的培養基重選細胞并均勻分到新的細胞培養瓶中，靜置培養。
    6. 傳代完成24小時(shí)后建議觀(guān)察細胞并換液，以去除死亡細胞。 
    注：NEST細胞培養瓶規格齊全，表面經(jīng)過(guò)TC處理，細胞貼壁效果極佳。同時(shí)NEST已推出新品細胞培養基及細胞鹽溶液（PBS），助力細胞培養。


    03.細胞復蘇
    1. 當細胞傳代次數過(guò)多（超過(guò)50代），細胞狀態(tài)變差時(shí)或細胞出現污染事故時(shí)，需要丟棄原有細胞并對一開(kāi)始凍存的細胞進(jìn)行復蘇。
    2. 打開(kāi)水浴鍋，設置溫度為40℃。
    3. 查看NEST樣本管理系統的記錄，根據記錄從液氮氣象中取出凍存的細胞，迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，在1~2 min內使細胞溶液完全溶解。
    4. 加入培養基中并混勻后轉入細胞培養瓶。
    5. 放回37攝氏度、3%二氧化碳和95%相對濕度的培養箱中培養。
    6. 第二天觀(guān)察細胞存活率。倒掉舊的培養基，加入新鮮培養基。注：可使用耐思新推出細胞復蘇儀替代原始細胞復蘇過(guò)程，細胞復蘇時(shí)間短，細胞存活率高。



    Q&A

    01.細胞密度如何計算
    常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值。
    這種計算方式優(yōu)點(diǎn)是直觀(guān)簡(jiǎn)便，但受限于單個(gè)細胞在不同的生長(cháng)密度時(shí)所占用的培養面積不同，導致計算并不嚴謹。

    02.培養過(guò)程中細胞碎片較多
    • 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡以及細胞器的折光，這個(gè)屬于細胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變。而細胞對培養環(huán)境不適應、缺乏營(yíng)養、滲透壓有異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議適當改變培養條件。
    • 細胞外的黑色顆粒為細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，需要先舍棄原有培養基后用PBS潤洗清除細胞碎片，加入新的培養基后繼續培養。
      如果潤洗無(wú)法清除細胞碎片，可以等細胞密度處在70-80%左右時(shí)消化處理細胞，終止消化之后混勻細胞，收集細胞懸液在900-1000rpm條件下離心3分鐘，舍棄上清液。重懸細胞→離心→再重懸后將細胞懸液接種到新的培養瓶。
      第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果碎片很多，建議用PBS多次潤洗細胞。

    03.細胞出現聚團現象
    • 細胞傳代過(guò)程中需要盡可能地吹散細胞，并在顯微鏡下確認細胞基本分散后再把細胞接種到培養瓶中。
    • 優(yōu)質(zhì)的培養體系能有效避免細胞吹散后在貼壁時(shí)再聚團的現象， 也可以減輕細胞聚團后無(wú)法重新攤開(kāi)生長(cháng)的癥狀。
    • 培養過(guò)程中輕微聚團可以稍微延長(cháng)消化時(shí)間，讓大團細胞塊下沉后吸取上層的分散細胞進(jìn)行傳代。若聚團過(guò)于嚴重建議重新培養或者更換培養體系。


    
                
    
        
    

        
        
        
        
    
    

    

    
    
    
    
    
    
        
    
    
    
    

    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    



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