“1971 年，Judah Folkman 教授提出 “腫瘤生長(cháng)和轉移依賴(lài)于血管新生” 理論，認為新血管的形成對于腫瘤生長(cháng)和轉移至關(guān)重要?！?/p>
腫瘤細胞需要新生血管來(lái)提供營(yíng)養和氧氣，以維持其持續生長(cháng)和擴散。研究腫瘤細胞的血管生成能力和血管侵襲能力對于了解腫瘤生物學(xué)機制，以及發(fā)展抗腫瘤治療策略具有重要意義。成血管實(shí)驗可以模擬腫瘤微環(huán)境，評估腫瘤細胞及其周?chē)毎麑ρ苌傻挠绊憽?/p>
成血管實(shí)驗怎樣設計？
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一文走進(jìn)熱門(mén)實(shí)驗技術(shù)，為發(fā)表高分文獻提供新思路，“膠”你做實(shí)驗！
TIPS：
l 在成血管前需要饑餓培養細胞，以增加細胞對生長(cháng)因子和刺激因子的敏感性，促進(jìn)血管生成。常用于成血管研究的細胞類(lèi)型有 HUVEC、HMVEC、HMEC-1 等
l 在成血管實(shí)驗中通常有對照組與添加促進(jìn)或抑制血管生成的藥物進(jìn)行對比，以研究該藥物對腫瘤細胞成血管的影響。
l 一般成血管實(shí)驗使用的基質(zhì)膠濃度建議至少 10mg/mL，更高濃度的基質(zhì)膠效果會(huì )縮短血管開(kāi)始形成的時(shí)間，并且血管形成時(shí)間更長(cháng)，易于確定觀(guān)察時(shí)間窗口。
前排插播
前排插播
NEST 的 GelNestTM基質(zhì)膠取自小鼠腫瘤組織，可增強細胞粘附、分化和增殖。它模擬生理環(huán)境，是組織工程和細胞培養研究的理想選擇，尤其適用于類(lèi)器官和干細胞培養。它還有助于癌癥研究，如侵襲、血管生成和體內腫瘤形成實(shí)驗。
成血管專(zhuān)用款基質(zhì)膠濃度在 12-14mg/mL，相比標準款與低因子款更適合用于體外成血管實(shí)驗。
材料與方法
材料與方法
Part.01 GelNestTM成血管專(zhuān)用基質(zhì)膠包被
1. 在 96 孔板的底部均勻鋪上 50μL GelNest?基質(zhì)膠原液（推薦 211492，濃度>12mg/mL），添加時(shí)避免氣泡產(chǎn)生。24 孔每孔約加 280μL，其他孔板按培養面積大小增減。（為防止基質(zhì)膠粘附在槍頭內壁， 在吸取基質(zhì)膠前可用槍頭吹吸一次 FBS，對槍頭內壁進(jìn)行 FBS 潤洗。）
2. 將培養板置于 37℃培養箱 30 至 60 分鐘。若有液體剩余，可用移液槍輕輕吸出。
3. 包被好的培養板請盡快使用。
Part.02 HUVEC細胞培養與成血管
1. 將 HUVEC 細胞培養至 70-80%的匯合度，原代細胞代數應該在 5 代以?xún)取?/p>
2. 將完全培養基替換成饑餓細胞用培養基：含 0.2% FBS（減血清）、2mM L-谷氨酰胺、1mM 丙酮酸鈉、100U/mL 青霉素和 100μg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養基，饑餓培養 24 小時(shí)。
3. 胰酶消化 HUVEC 細胞并進(jìn)行細胞計數。
4. 將 5x104個(gè) HUVEC 細胞加入含基質(zhì)膠的 96 孔板的單孔中，每孔體積控制在 200μL。將 96 孔板放入培養箱中進(jìn)行培養。
5. 血管樣網(wǎng)絡(luò )結構預計將在 3 至 12 小時(shí)內形成。首次實(shí)驗請每隔一小時(shí)觀(guān)察一次，以防血管結構繼續分化，錯過(guò)觀(guān)察窗口。
Part.03 染色與觀(guān)察
1. 血管樣網(wǎng)絡(luò )結構可以直接用相差顯微鏡觀(guān)察，也可以用以下步驟進(jìn)行熒光染色。
2. 小心去除培養基，避免破壞血管結構。加入200μL HBSS緩沖液潤洗兩次，并除去。
3. 加入1/1000濃度的Calcein AM（綠色）培養基進(jìn)行染色。
4. 使用熒光顯微鏡對細胞進(jìn)行成像，并記錄分析血管網(wǎng)絡(luò )的形態(tài)和特征。
實(shí)驗結果分析
實(shí)驗結果分析
圖 1.HUVEC 細胞分別在競品和本公司（GelNest Matrix）基質(zhì)膠上培養 9 個(gè)小時(shí)后形成血管網(wǎng)絡(luò )的結果。標尺為 300μm。
可觀(guān)察到在 GelNestTM 基質(zhì)膠中血管樣網(wǎng)絡(luò )結構形成良好。
常見(jiàn)問(wèn)題與解答
常見(jiàn)問(wèn)題與解答
1. 應該采用何種培養基稀釋基質(zhì)膠？
建議使用不加雙抗、不加胎牛血清的高糖DMEM培養基稀釋基質(zhì)膠。
2. 如何使鋪膠更均勻？
槍頭要垂直于內孔的正上方，防止有基質(zhì)膠流經(jīng)孔壁殘留。
若是孔的底部沒(méi)有鋪滿(mǎn)基質(zhì)膠，可以晃動(dòng)一下96孔板，使底部鋪膠均勻。
若還是沒(méi)有均勻鋪滿(mǎn)底部，可用槍頭稍微攪動(dòng)一下。
3. HUVEC必須用專(zhuān)用培養基嗎？能不能用普通培養基？
(1) 若使用普通培養基需要添加生長(cháng)因子，常見(jiàn)的有ECGF/ECGF，ECGF。
(2) 普通培養基+生長(cháng)因子的方式價(jià)格較貴，建議使用專(zhuān)用ECM內皮專(zhuān)用培養基。
4. HUVEC細胞系換液第二天為何出現空泡化？如何解決空泡化問(wèn)題？
可能原因：
(1) 培養液的pH值與細胞正常所需pH值差別太大，細胞代謝異常導致空泡化；
(2) 在細胞培養過(guò)程中由于血清濃度不夠、藥物作用、外界刺激等情況，導致細胞代謝出現問(wèn)題，內質(zhì)網(wǎng)應激導致出現細胞空泡化的情況。
解決方法：
(1)測定完全培養基的pH，看其酸堿性是否適宜。多數細胞適宜的pH范圍為7.2-7.4。
(2)若培養基或血清是已開(kāi)封且存放了很久，建議使用新鮮的完全培養基給細胞換液；若都是新開(kāi)封的，建議使用新批次的基礎培養基或血清來(lái)配制培養液，給細胞換液并進(jìn)行觀(guān)察。
5. HUVEC培養過(guò)程中出現聚團如何處理？
聚團可能是因為培養板親水性差或者血清中的促貼壁因子不足。
解決方法：
(1) 培養瓶使用前一天使用明膠包被。
包被方法：以T25瓶為例，取用5mL明膠放入T25瓶中，37℃放置30分鐘以上，將多余的明膠吸出。
(2) 提高培養液中基質(zhì)膠濃度。
(3) 使用ECM內皮專(zhuān)用培養基進(jìn)行配置。
6. 如何判斷加入的基質(zhì)膠體積是否合適？
在孔板下方放置一張格子紙(如圖)，垂直透過(guò)每個(gè)孔觀(guān)察：
(1) 如果觀(guān)察到的格子比實(shí)際尺寸小，基質(zhì)膠加入的體積過(guò)少；
(2) 如果觀(guān)察到的格子比實(shí)際尺寸大，基質(zhì)膠加入的體積過(guò)多；
(3) 如果觀(guān)察到的格子與實(shí)際尺寸一致，基質(zhì)膠加入的體積適合。
7. 如何解決成管實(shí)驗中細胞不能形成連續的網(wǎng)格的問(wèn)題？
建議使用3-5代狀態(tài)較好且融合度70%-80%的HUVEC細胞進(jìn)行成管試驗，此時(shí)的細胞成管能力較強。
在顯微鏡下邊觀(guān)察邊使用胰酶消化細胞，當細胞變圓時(shí)及時(shí)終止消化過(guò)程。消化過(guò)度會(huì )影響成管效果。
盡可能保證細胞數量約為3萬(wàn)個(gè)/孔，細胞數量過(guò)少會(huì )使細胞無(wú)法形成連續的網(wǎng)絡(luò )。
選擇低生長(cháng)因子基質(zhì)膠進(jìn)行成管實(shí)驗時(shí)，可考慮在培養基中添加生長(cháng)因子，刺激細胞形成網(wǎng)絡(luò )狀。
8. 細胞鋪板數量如何確定？
由于計數方式的差異可能導致細胞數量的差異，可進(jìn)行預實(shí)驗測試合適的細胞數鋪板，適宜的細胞數量如下圖：
9. 成管實(shí)驗需要幾個(gè)小時(shí)？小管形成后為何會(huì )塌縮？
成管時(shí)間與細胞狀態(tài)密切相關(guān)。細胞狀態(tài)好時(shí)，2-3小時(shí)開(kāi)始成管，細胞狀態(tài)較差時(shí)，可能18-24h成管。建議第一次實(shí)驗時(shí)，每隔一個(gè)小時(shí)觀(guān)察一次。
成管時(shí)間取決于培養基中血管生成因子的濃度。腫瘤條件培養基中血管生成因子較豐富，容易成管，而基礎培養基所需要的成管時(shí)間較久。
如果使用原代內皮細胞而非永生化細胞，開(kāi)始成管的時(shí)間會(huì )延遲數個(gè)小時(shí)。
小管形成后有塌縮可能是培養時(shí)間過(guò)久，內皮細胞發(fā)生凋亡。
10. 血管形成實(shí)驗中使用的凝膠是否需要含酚紅？
對于使用相差顯微鏡，酚紅不會(huì )干擾圖片，并且由于其顏色，處理更容易。
然而，當使用熒光顯微鏡時(shí)，酚紅可能會(huì )干擾探頭的波長(cháng)。在這種情況下，最好使用無(wú)酚紅凝膠。
